세포 배양의 동결 보존을위한 기본 팁

세포 배양의 동결 보존을위한 기본 팁

세포는 정상적인 성장 활동 동안 신진 대사를 계속하며 다양한 프로테아제의 참여가 필요합니다. 온도가 -70 ° C 아래로 떨어지면 프로테아제가 작동을 멈 춥니 다. 따라서 온도가 매우 낮은 환경에서 세포는 대사 활동을 중단하고 장기 저장을 허용하는 휴면 상태로 들어갈 수 있습니다.

1. 실험 재료

기본 자료 :

기본 문화 매체

혈청 (기존 FBS/NBS)

초음파 워크 벤치

멸균 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)

멸균 PBS 포스페이트 완충액 염 용액

피펫 팅 총

전기 피펫 팅 총

실험의 준비

a) 동결 용액의 준비 :

일반 세포 : 55% 기저 중간 + 40% 소 혈청 (FBS/NBS) + 5% DMSO

생명 세포 : 90% 소 혈청 (FBS/NBS) + 10% DMSO

제조 된 동결 보존 용액을 15 mL 원심 분리 튜브 [Nest]로 분취하고 나중에 사용하기 위해 4 ℃에 보관한다.

(b) 냉동 될 세포의 제조 :

세포를 얼리기 전에, 성장 상태가 우수하고 로그 성장 단계에서 세포를 선택하고 균열 상태를 유지하기 위해 동결하기 전에 12-24 시간 전에 신선한 배지로 대체하십시오.

2. 실험 절차

1. 세포의 밀도가 약 80%~ 90%인 냉동되는 것을 관찰하십시오. 피펫 건을 사용하여 오래된 매체를 흡인하고 멸균 PBS를 첨가하여 세포를 1-2 회 씻은 다음 배양 환경에서 나머지 매체를 제거하십시오.

2. 트립신이 세포에 들어가도록하기 위해 적절한 양의 트립신 또는 소화 주스를 넣고 소화를 위해 인큐베이터에 넣습니다. 현미경 하에서 세포의 상태를 관찰하십시오 : 세포질이 수축되고 세포는 더 이상 시트에 연결되지 않습니다. 이 시점에서 정지 솔루션을 추가하여 소화 과정을 중지하십시오.

3. 팁으로 세포를 부드럽게 거품하여 세포 현탁액을 형성하고 3-5 분 동안 1000rpm에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다.

상청액을 폐기하고 적절한 양의 동결 용액을 추가 한 다음 부드럽게 피펫을 뿌려 세포를 균일하게 계산합니다. 냉동 보존 매체로 세포 밀도를 조정하여 최종 밀도 5 × 106/ml ~ 1 × 107/ml를 만듭니다.

4. 피펫 건을 사용하여 예상 용량에 따라 극저온 튜브를 분리하고 자동 캡핑 기계를 사용하여 캡 및 밀봉하십시오.

5. 표준 냉동 보존 프로그램은 -1 ° C ~ -2 ° C/분의 냉각 속도이며, 냉동 될 셀은 다음 단계에 따라 점차적으로 동결 될 수 있습니다. 실온 → 4 ° C (20 분) → - - - 20 ° C (30 분) → -80 ° C ° C (밤새) → 액체 질소에서 장기 저장.

또한 -80 ° C에서 냉동고에 하룻밤에 직접 저장 한 다음 저장을 위해 액체 질소로 옮길 수 있습니다.

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